牛乳含有豐富優質全價的營養成分,是易消化吸收的天然食物。其中蛋白質含量為30～35g/L,大約80%為酪蛋白(26g/L),其余的20%為乳清蛋白(6g/L)。酪蛋白是在20℃的條件下將脫脂乳用酸調節pH4.6時沉淀的蛋白質。酪蛋白的主要成分是αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白。它們在結構和性質上存在著顯著的差異且具有廣泛的用途,如用于開發嬰兒配方乳,生產酪蛋白源生物活性肽,生產出功能特性更強的蛋白質,優化奶酪和奶酪風味物質的生產過程等。由于酪蛋白分級分離產物的功能眾多,其分離純化制備工作也是關注的焦點,本文的目的就是以干酪素為原料,研究酪蛋白分級分離的方法,以期將酪蛋白主要成份αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白分離制取,使酪蛋白的使用領域增大,實用性增強和產品附加值提高并有利于各種乳及乳制品的深加工和資源利用。實驗主要由四個部分組成。 第一部分,以SinoChrom 300A C8柱為分離柱,建立了高效液相色譜法測定酪蛋白組分的方法。結果表明,干酪素樣品用含2%巰基乙醇和1%的檸檬酸鈉的7M的尿素溶液處理后,以水(內含體積分數為0.1%TFA)和乙腈(內含體積分數為0.1%TFA)分別為流動A相和B相,在梯度洗脫流速1. 0mL/min,檢測波長214nm條件下,酪蛋白組分能被有效分離且具有較大的響應值,線性關系良好,峰面積和保留時間具有良好的穩定性,加樣回收率較好,建立的方法切實可行。 第二部分,以Q-Sepharose Fast Flow為離子交換介質,以干酪素為原料,對其直接用于酪蛋白組分的分離進行了研究。首先確定了其吸附pH,吸附容量,接著討論了流速,洗脫程序對分離的影響,最終結果為流動相:A相為含4M尿素、0.5%ME,pH8.0的20mM的Tris-HCl緩沖液,Β相為含2M氯化鈉的A相溶液,pH仍為8,洗脫流速1ml/min,檢測波長280nm。以分步洗脫為洗脫方式,該洗脫程序能夠實現各酪蛋白的初步富集,并為進一步的分離打下基礎。 第三部分,研究了尿素沉淀法分離酪蛋白的條件,分析了尿素濃度、酪蛋白濃度、沉淀溫度對分離的影響。先進行單因素試驗,再在各單因素最佳水平值的基礎上,通過L9(34)正交實驗結果確定了溫度、酪蛋白濃度、尿素濃度這幾個因素的最佳水平值組合得沉淀溫度40℃,酪蛋白濃度6%,尿素濃度3.2mol/L。然后將尿素沉淀法與離子交換層析法接合對干酪素進行分級分離,最終得κ-酪蛋白的相對純度57.3%,回收率49.8%;αs-酪蛋白相對純度75.4%,回收率73.8%;β-酪蛋白相對純度87.9%,回收率62.0%。 第四部分,以離子交換層析后的αs-酪蛋白部分的收集液為例,利用交聯葡聚糖Sephadex G-25進行了凝膠過濾脫鹽操作,以含40mM碳酸氫氨的pH為8的溶液為流動相,從上樣體積和洗脫流速進行討論,得最佳上樣量為3ml,最佳洗脫流速4ml。該層析過程能有效的去處離子交換層析中引入的鹽分,且快速方便,非常有利于提高分離效率和節約分離時間。

作者：佚名　　來源：知網空間